第四部分：綠膿桿菌之檢驗

Part Ⅳ：Test of Pseudomonas aeruginosa

1. 適用範圍：本方法適用於化粧品中綠膿桿菌之檢驗。

2. 檢驗方法：檢體經稀釋後，以選擇性培養基培養後進行鑑別之方法。

3. 1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為 100 呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每 15 分鐘落菌數不得超過 15 CFU/培養皿。

4. 器具及材料：

5. 1. 無塵無菌操作台。
6. 1. 高壓滅菌釜。
7. 1. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1.0°C以內者。
8. 1. 天平：可秤量到2000 g，靈敏度為0.1 g；可秤量到120 g，靈敏度為5 mg。
   2. 旋渦混合器(Vortex mixer)。
9. 1. 酸鹼度測定儀(pH meter)。
10. 1. 菌落計數器：適用於菌落之計算者。
11. 1. 吸管輔助器(Pipette aid)。
12. 1. 吸管(Pipette)：已滅菌。1 mL吸管應有0.01 mL之刻度；5 mL 及10 mL吸管應有0.1 mL刻度。
    2. 玻璃珠：直徑約5～7 mm，已滅菌。
13. 1. 培養皿：已滅菌，內徑約90 mm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他缺點。
14. 1. 稀釋用容器：無菌袋或有100 mL、50 mL或10 mL標記附蓋(栓)之可滅菌廣口瓶或試管。
15. 1. 彎曲塗抹玻棒、紗布墊、藥勺、抹刀、剪刀及鑷子：可滅菌或可拋棄式者。
16. 1. 試藥：

氯化鈉、氯化鎂(MgCl₂)、氯仿(chloroform)、硝酸鉀(KNO₃)、亞硫酸氫鈉(NaHSO₃)、硫酸銨［(NH₄)₂SO₄］、硫酸鎂(MgSO₄)、硫酸鎂(MgSO₄．7H₂O)、N,N,N’,N’-四甲基對苯二胺鹽酸鹽 (N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine. 2HCl)、對-胺基苯磺酸(salfanilic acid)、萘基乙二胺鹽酸鹽［N-(1-naphthyl) ethylene diamine dihydrochloride］、抗壞血酸(ascorbic acid)、硫酸鉀 (K₂SO₄) 、磷酸氫二鉀 (K₂HPO₄) 、磷酸氫銨鈉(NaNH₄HPO₄ ． 4H₂O)、磷酸二氫鉀 (KH₂PO₄)、丙二酸鈉 (sodium malonate)、硫酸銨亞鐵［Fe (NH₄)₂ (SO₄)₂．6H₂O］、硫代硫酸鈉(Na₂S₂O₃)、Tween 80、檸檬酸鈉(Na₃C₆H₅O₇．2H₂O)、酚紅(phenol red)、溴甲酚紫(bromcresol purple)、碘化鉀、碘、沙黃 O (safranin O)、甘油(glycerol)、草酸銨 (ammonium oxalate)、硫酸、冰醋酸、葡萄糖(glucose)、乳糖 (lactose) 、蔗糖 (sucrose) 、精胺酸 (arginine) 、溴麝香草藍 (bromothymol blue)、膽汁鹽(bile salts No.3)、中性紅(neutral red)、結晶紫(crystal violet)、溴化十六烷基三甲銨(C₁₉H₄₂BrN)及 95%乙醇均採用化學試藥級。Letheen 培養液(Letheen broth)、胰化酪蛋白腖(trypticase peptone)、硫蛋白腖(thiotone peptone)、酵母抽出物(yeast extract)、洋菜(agar)、聚蛋白腖(polypeptone)、蛋白腖(peptone)、胰蛋白腖(tryptose)、牛心浸出物培養基 (Heart infusion agar) 、䏡 蛋白腖 (proteose peptone)、3 號䏡蛋白腖(proteose peptone No.3)、胰化蛋白腖(tryptone)、浸出培養液(infusion broth)、明膠(gelatin)及胰化明膠(pancreatic digest of gelatin)均採用微生物級。

1. 試劑：

2. 1. 70%乙醇溶液：

取95%乙醇560 mL，溶於蒸餾水200 mL，混合均勻。

• 1. 生理食鹽水：

取氯化鈉8.5 g，溶於蒸餾水1000 mL，分裝於稀釋用容器中，經121°C滅菌15分鐘。

• 1. 1N硫酸溶液：

取硫酸20 mL，溶於蒸餾水340 mL，混合均勻。

1. 5N醋酸溶液：

取冰醋酸100 mL，溶於蒸餾水240 mL，混合均勻。

1. 革蘭氏染色液(Gram stain solution)：

2. 1. 哈克氏(Hucker's)結晶紫液(初染劑)：

溶液A：取結晶紫2 g，溶於95%乙醇20 mL。溶液B：取草酸銨0.8 g，溶於蒸餾水80 mL。

將溶液A與溶液B混合，靜置24小時後以濾紙過濾，取濾液作為初染劑。

• 1. 革蘭氏碘液(媒染劑)：取碘化鉀2 g及碘1 g，置於研缽中，研磨5～10秒，加

蒸餾水1 mL研磨，次加蒸餾水5 mL研磨，再加蒸餾水10 mL，研磨至碘化鉀和碘完全溶於蒸餾水中，將此溶液注入褐色瓶中，再以適量蒸餾水洗滌研缽及杵後，以此洗液併入，使溶液達300 mL。

• 1. 哈克氏複染液(複染劑)：取沙黃 O 2.5 g，溶於 95%乙醇 100 mL，供作複染原

液。使用時，取原液 10 mL，加入蒸餾水 90 mL，作為複染液。

註：革蘭氏染色液因放久可能失效，購買成品時，需注意其保存期限；自行配製者，應檢查其染色效果。

1. 營養明膠(Nutrient gelatin)

取浸出培養液(infusion broth) 25 g及明膠(gelatin) 120 g，

溶於蒸餾水1000 mL。加熱溶解後，調整pH值至7.4 0.2，取4 mL，分裝於試管中，以121°C滅菌15分鐘。

1. 氧化酶試劑(Oxidase reagent)

2. • • N,N,N’,N’- 四 甲 基 對 苯 二 胺 鹽 酸 鹽(N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine. 2HCl) 1 g 及抗壞血酸 0.1 g，溶於蒸餾水 100 mL。置於褐色試藥瓶中冷藏備用，限一週內使用。

2.2.15.8. 亞硝酸鹽試驗試劑(Nitrite test reagents)：

試劑 A：取對-胺基苯磺酸 1 g，溶於 5N 醋酸溶液 125

mL。

試劑B：取萘基乙二胺鹽酸鹽0.25 g，溶於5 N醋酸溶液200 mL。

1. 培養基

2. 1. 改良式Letheen培養液(Modified letheen broth, MLB)

加熱沸騰溶解後，分取5 mL，注入試管內，以118℃滅菌15分鐘，最後pH值為7.3 ± 0.2。滅菌後作成斜面培養基，斜面長度約4～5 cm，斜面底部之深度約2～3 cm。

加熱沸騰溶解後，分裝於試管或三角瓶內，以121°C滅菌

加熱溶解後，分取 4 mL 注入試管內，以 121°C 滅菌 15

分鐘。

2.2.16.6. 精胺酸脫羧酶培養液(Arginine decarboxylase medium)

稱取 45.3 g 於 1000 mL 蒸餾水，再加入甘油 10 mL，混合均勻，加熱均勻攪拌溶解後，以 118°C 滅菌 15 分鐘，最後 pH 值為 7.2 ± 0.2。

溶解後，分取10 mL注入試管內，以121°C滅菌15分鐘，最終pH值為6.7 ± 0.2。

1. 檢液之調製

2. 1. 液態檢體：

精確量取檢體 1 mL，置於滅菌試管，加入 MLB 9 mL，混合均勻，作為 10 倍稀釋檢液。

• 1. 固態與粉末檢體：

精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入經121°C滅菌15分鐘之Tween 80 1 mL，利用抹刀將檢體分散後，再加入MLB 8 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。

• 1. 面霜與油脂類檢體：

精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入經121°C滅菌15分鐘之Tween 80 1 mL、無菌玻璃珠5～7顆及MLB 8 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。

• 1. 噴霧劑：

以70%乙醇溶液濕潤之紗布消毒噴霧器之噴嘴，先從噴嘴噴出部分檢體於無菌紗布墊，丟棄，再將檢體噴灑於稀釋瓶中，精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入MLB 9 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。

• 1. 無水材料類檢體：參照2.3.2.與2.3.3.節。

依檢體之大小，適量取1～10 g (mL)，依2.3.節之方法加入適量之MLB，作為10倍稀釋檢液。

1. 鑑別試驗：

2. 1. 分離培養：

2.3.節之10倍稀釋檢液於30°C培養48小時，以無菌接種環取一環耳劃線培養於馬康奇培養基及溴化十六烷基三甲銨培養基上，於35°C培養24小時，若在馬康奇培養基菌落呈現白色菌落且在溴化十六烷基三甲銨培養基上有菌落生長，則可能為綠膿桿菌。

• 1. 初步試驗：

自馬康奇培養基或溴化十六烷基三甲銨培養基上鉤菌，進行革蘭氏染色(Gram stain)、三糖鐵斜面培養基試驗和氧化酶試驗(oxidase test)，結果為正反應者，則應進行2.4.3.節的生化試驗。

• • 1. 革蘭氏染色鏡檢：
• • • 1. 鉤取適當菌量，與滴在載玻片上的無菌生理食鹽水混合，製成薄抹片，採自然風乾固定，勿用火烤。
• • • 1. 初染：將已固定之抹片，用哈克氏結晶紫液染1分鐘後，水洗，水洗時間應不超過5秒鐘。
      2. 媒染：加革蘭氏碘液作用1分鐘後，水洗。
• • 1. 脫色：用95%乙醇洗至不再有紫色褪出時，再以水洗。此步驟需時甚短，僅數秒鐘即可，惟視抹片之厚薄而定。
• • 1. 複染：用複染液複染30秒鐘，水洗。
• • 1. 自然風乾。
• • 1. 鏡檢：呈現深紫色者為革蘭氏陽性菌，呈現淡紅色者為革蘭氏陰性菌。綠膿桿菌為革蘭氏陰性桿菌。
• 1. 三糖鐵斜面培養基試驗：自溴化十六烷基三甲銨培養基上選取典型菌落接種於

TSI 斜面上及穿刺其底部，於 35°C 培養 24 小時，若 TSI 斜面顯示紅色且斜面底部亦顯示紅色為正反應(+)，若斜面呈黃色或有汽泡產生，則為負反應(-)，綠膿桿菌為正反應。

註：某些假單孢菌可能會產生微量的硫化氫，致使TSI斜面顏色變成黑色。

• 1. 氧化酶測試：

使用無菌鉑銥接種針(避免使用鎳鉻製品)或牙籤或小木棒，自平板培養基或斜面培養基鉤取少量新鮮菌株，塗抹於氧化試劑潤濕之濾紙上，10秒鐘內變為深紫藍色者為正反應，否則為負反應。綠膿桿菌為正反應。

1. 生化試驗：

2. 1. 42°C 生長試驗：

自 TSI 斜面鉤菌接種於兩個酵母菌抽出物培養基斜面上，一酵母菌抽出物培養基斜面於 35°C 培養 24 小時，另一斜面於 42°C 培養 24 小時。綠膿桿菌可生長在酵母菌抽出物培養基上並會產生腥味(fishy odor)。

註：在進行試驗前須將酵母菌抽出物培養基斜面先置於42℃培養箱下 30~60 分鐘進行預熱，若無進行預熱，則

有些假單孢菌有可能會在酵母菌抽出物培養基斜面上生成菌落，影響實驗結果判斷。

1. 檸檬酸鹽利用試驗(Citrate utilization test)：

2. • TSI斜面鉤菌接種於柯塞爾氏檸檬酸鹽培養液中，置於35°C培養箱中培養24～48小時後，呈現混濁狀，則為正反應(+)；仍維持原澄清狀則為負反應(-)，綠膿桿菌為正反應。

3. 丙二酸鹽試驗 (Malonate test)：

4. • TSI 斜面鉤菌接種於丙二酸鹽培養液中，置於 35°C培養箱中培養 24 ± 2 小時。培養液由綠色變為藍色者為正反應(+)；仍維持綠色者為負反應(-)，綠膿桿菌為正反應。

5. 硝酸鹽還原試驗(Nitrate reduction test)：

自 TSI 斜面鉤菌接種於硝酸鹽培養基中，置於 35°C 培養箱中培養 18～24 小時，取培養液 3 mL 至另一已滅菌之試管中，加入亞硝酸鹽試驗試劑 A 及試劑 B 各 2 滴，輕輕搖勻後觀察結果，呈現粉紅或紅色則為正反應(+)，若顏色無變化時有產生氣泡使培養基有裂紋時，表示硝酸被還原產生氮氣，視為正反應，綠膿桿菌為正反應。

1. 精氨酸脫酸酶試驗(Arginine decarboxylase test)：

自 TSI 斜面鉤菌以斜面劃線及穿剌法接種於精氨酸脫酸培養液，將上蓋旋緊，於 35 ± 2°C 培養 24 ± 2 小時，培養液維持紫色為正反應(+)；培養液呈黃色者為負反應(-)，綠膿桿菌為正反應。

1. 明膠液化試驗(Gelatin liquefaction)：

自 TSI 斜面鉤菌以斜面劃線及穿剌法接種於營養明膠，於 25°C 培養至少 72 小時，有液化現象者為正反應(+)，無液化現象者為負反應(-)，綠膿桿菌為正反應。

1. 螢光產生試驗：

自 TSI 斜面鉤菌畫線培養於假單孢菌螢光培養基，於25°C 下至少培養 3 天後以紫外光觀察，有螢光者為正反應(+)，無螢光者為負反應(-)，綠膿桿菌為正反應。

• 1. 色素產生試驗：

自TSI斜面鉤菌畫線培養於假單孢菌色素培養基，於25°C下至少培養3天，使用玻璃棒將假單孢菌色素培養基分成小塊狀並加入等量之蒸餾水，震盪直到色素被水洗出。將水層倒入分液漏斗，移至化學抽氣櫃中，加入氯仿5～10 mL，震搖後靜置等待分層。將有機層倒入試管中，加入蒸餾水3 mL，再加入1N硫酸溶液1滴，色素呈現紅色並移動至水層為正反應(+)，無色素產生為負反應(-)，綠膿桿菌為正反應。

1. 判定：生化反應可參照下表所列之結果。