第二部分：金黃色葡萄球菌之檢驗

Part Ⅱ：Test of Staphylococcus aureus

1. 適用範圍：本方法適用於化粧品中金黃色葡萄球菌之檢驗。

2. 檢驗方法：檢體經稀釋後，以選擇性培養基培養後進行鑑別之方法。

3. 1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為 100 呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每 15 分鐘落菌數不得超過 15 CFU/培養皿。

4. 器具及材料：

5. 1. 無塵無菌操作台。
6. 1. 高壓滅菌釜。
7. 1. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1.0°C以內者。
8. 1. 天平：可秤量到2000 g，靈敏度為0.1 g；可秤量到120 g，靈敏度為5 mg。
   2. 旋渦混合器(Vortex mixer)。
9. 1. 酸鹼度測定儀(pH meter)。
10. 1. 菌落計數器：適用於菌落之計算者。
11. 1. 吸管輔助器(Pipette aid)。
12. 1. 吸管(Pipette)：已滅菌。1 mL吸管應有0.01 mL之刻度；5 mL 及10 mL吸管應有0.1 mL刻度。
13. 1. 濾膜：孔徑0.45 m及0.22 m，Nylon材質。
14. 1. 玻璃珠：直徑約5～7 mm，已滅菌。
15. 1. 培養皿：已滅菌，內徑約90 mm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他缺點。
16. 1. 稀釋用容器：無菌袋或有100 mL、50 mL或10 mL標記附蓋(栓)之可滅菌廣口瓶或試管。
17. 1. 彎曲塗抹玻棒、紗布墊、藥勺、抹刀、剪刀及鑷子：可滅菌或可拋棄式者。
18. 1. 試藥：

氯化鈉、亞碲酸鉀(potassium tellurite)、30%過氧化氫溶液、磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄．12H₂O)、亞硫酸氫鈉(NaHSO₃)、乙二胺四醋酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、油酸聚醇山梨酯(Tween 80)、甘胺酸(glycine)、氯化鋰(LiCl．6H₂O)、葡萄糖(dextrose)及95%乙醇均採用化學試藥級。牛腦浸出物(calf brain infusion)、牛心浸出物(beef heart infusion)、䏡蛋白腖(proteose peptone)、Letheen洋菜(Letheen agar)、Letheen培養液(Letheen broth)、胰化酪蛋白腖 (trypticase peptone) 、硫蛋白腖 (thiotone peptone)、酵母抽出物(yeast extract)、胰化蛋白腖(tryptone)、牛肉抽出物(beef extract)、洋菜(agar)及凝固酶血漿(coagulase plasma，兔來源，經EDTA處理)均採用微生物級。

1. 試劑：

2. 1. 70%乙醇溶液：

取95%乙醇560 mL，溶於蒸餾水200 mL，混合均勻。

• 1. 生理食鹽水：

取氯化鈉8.5 g，溶於蒸餾水1000 mL，分裝於稀釋用容器中，經121°C滅菌15分鐘。

• 1. 1%亞碲酸鉀溶液：

取亞碲酸鉀 1 g，溶於蒸餾水 100 mL，稍加熱，使其完全溶解(如有白色不溶物存在，則亞碲酸鉀粉末不可使用)，經 0.22 μm 孔徑濾膜過濾，貯存於冰箱中備用，當有白色沉澱產生即不可使用，使用期限以不超過 1 個月為宜。

• 1. 3%過氧化氫溶液：

取30%過氧化氫溶液1 mL，加蒸餾水使成10 mL，使用時新鮮配製。

1. 培養基

2. 1. 腦心浸出培養液(Brain heart infusion broth, BHI)

加熱溶解後，分裝於三角瓶內或試管中，以121°C滅菌15分鐘，最終pH值為7.4 ± 0.2。

2.2.17.2. 改良式Letheen培養液(Modified letheen broth, MLB)

加熱溶解後，以121°C滅菌15分鐘，最後pH值為7.2 ± 0.2。

2.2.17.3. 改良式Letheen培養基(Modified letheen agar, MLA)

加熱溶解後，以121°C滅菌15分鐘，最後pH值為7.2 ± 0.2。

取20 mL分裝於已滅菌之培養皿。

1. 巴德派克培養基(Baird-Parker agar, BP) 基礎培養基(basal medium)

加熱溶解後以 121°C 滅菌 15 分鐘，最終 pH 值為 7.0 ±0.2。

蛋黃亞碲酸鹽強化培養液(Egg yolk tellurite enrichment, EYT)

蛋洗淨後，浸入 70%乙醇溶液中 1 小時。以無菌操作，取出蛋黃，加入無菌生理食鹽水，以體積 3:7 之比例混合攪拌均勻後，取 50 mL，加入經 0.45 μm 孔徑濾膜過濾之 1%亞碲酸鉀溶液 10 mL，混合均勻後貯存於冰箱中備用。

完全培養基(Complete medium)

將基礎培養基冷卻至45～50°C時加入EYT，以體積95:5之比例混合均勻。培養基注入培養皿前，應搖動混合使絮狀沈澱物分散均勻，搖動時應避免產生氣泡，每一培養皿約倒入15～20 mL，凝固後呈不透明，使用前應使表面乾燥。製備好之培養基置於20～25°C，使用期限以不超過5天為宜。

1. 檢液之調製

2. 1. 液態檢體：

精確量取檢體 1 mL，置於滅菌試管，加入 MLB 9 mL，混合均勻，作為 10 倍稀釋檢液。

• 1. 固態與粉末檢體：

精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入經121°C滅菌15分鐘

之Tween 80 1 mL，利用抹刀將檢體分散後，再加入MLB 8

mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。

• 1. 面霜與油脂類檢體：

精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入經121°C滅菌15分鐘之Tween 80 1 mL、無菌玻璃珠5～7顆及MLB 8 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。

• 1. 噴霧劑：

以70%乙醇溶液濕潤之紗布消毒噴霧器之噴嘴，先從噴嘴噴出部分檢體於無菌紗布墊，丟棄，再將檢體噴灑於稀釋瓶中，精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入MLB 9 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。

• 1. 無水材料類檢體：參照2.3.2.與2.3.3.節。

依檢體之大小，適量取1～10 g (mL)，依2.3.節之方法加入適量之MLB，作為10倍稀釋檢液。

1. 鑑別試驗：

2. 1. 分離培養：

2.3.節之10倍稀釋檢液於30°C培養48小時，以無菌接種環取一環耳劃線培養於BP培養基上，於35°C培養48小時，觀察所形成菌落之生長狀態。菌落為圓形，直徑2～3 mm，表面凸起、平滑、具乳酪膠狀，呈灰黑色或黑色，周邊色淡，菌落外圍依序由內而外，有不透明環及透明環環繞，則為可疑之金黃色葡萄球菌。自BP培養基上鉤取可疑菌落劃線培養於MLA上，於35°C培養18～24小時後進行生化試驗鑑定。

• 1. 生化試驗：
• • 1. 觸酶試驗(Catalase test)：

自2.4.1.節之MLA培養基上鉤菌塗抹於載玻片上，加3%過氧化氫溶液1～2滴，觀察有無氣泡產生。產生氣泡者，為正反應；不產生氣泡者，為負反應。金黃色葡萄球菌為正反應。

• • 1. 凝固酶試驗(Coagulase test)：

自2.4.1.節之MLA培養基上鉤菌至含BHI培養液0.2 mL之試管中，於35 ± 2°C培養18～24小時，加入凝固酶血漿 0.5 mL，於35°C培養6小時，每隔1小時觀察有無凝塊之形成，若無凝塊形成時，應繼續培養至24小時觀察之，每組檢體應各做一正負對照組作為對照依據，金黃色葡萄球菌為正反應。

1. 判定：觸酶試驗與凝固酶試驗皆為正反應者，為金黃色葡萄球菌陽性。