第三部分：大腸桿菌之檢驗

Part Ⅲ：Test of Escherichia coli

1. 適用範圍：本方法適用於化粧品中大腸桿菌之檢驗。

2. 檢驗方法：檢體經稀釋後，以選擇性培養基培養後進行鑑別之方法。

3. 1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為 100 呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流

動空氣。每 15 分鐘落菌數不得超過 15 CFU/培養皿。

1. 器具及材料：

2. 1. 無塵無菌操作台。
3. 1. 高壓滅菌釜。
4. 1. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1.0°C以內者。
5. 1. 天平：可秤量到2000 g，靈敏度為0.1 g；可秤量到120 g，靈敏度為5 mg。
   2. 旋渦混合器(Vortex mixer)。
6. 1. 酸鹼度測定儀(pH meter)。
7. 1. 菌落計數器：適用於菌落之計算者。
8. 1. 吸管輔助器(Pipette aid)。
9. 1. 吸管(Pipette)：已滅菌。1 mL吸管應有0.01 mL之刻度；5 mL 及10 mL吸管應有0.1 mL刻度。
   2. 玻璃珠：直徑約5～7 mm，已滅菌。
10. 1. 培養皿：已滅菌，內徑約90 mm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他缺點。
11. 1. 稀釋用容器：無菌袋或有100 mL、50 mL或10 mL標記附蓋(栓)之可滅菌廣口瓶或試管。
12. 1. 彎曲塗抹玻棒、紗布墊、藥勺、抹刀、剪刀及鑷子：可滅菌或可拋棄式者。
13. 1. 試藥：

氯化鈉、伊紅Y(eosin Y)、亞甲藍(methylene blue)、結晶紫

(crystal violet)、亞硫酸氫鈉(NaHSO₃)、膽汁鹽(bile salts No.3)、中性紅(neutral red)、磷酸氫二鉀(K₂HPO₄)、乳糖(lactose)及 95% 乙醇均採用化學試藥級。Letheen培養液(Letheen broth)、胰化酪蛋白腖 (trypticase peptone) 、硫蛋白腖 (thiotone peptone)、酵母抽出物(yeast extract)、聚蛋白腖(polypeptone)、蛋白腖(peptone)及洋菜(agar)均採用微生物級。

1. 70%乙醇溶液：

取95%乙醇560 mL，溶於蒸餾水200 mL，混合均勻。

1. 培養基

2. 1. 改良式Letheen培養液(Modified letheen broth, MLB)

加熱沸騰溶解後，分裝於試管或三角瓶內，以121°C滅菌

15分鐘，最終pH值為7.1 ± 0.2。

2.2.16.3. 伊紅亞甲藍培養基(Levine’s eosin methylene blue agar, L-EMB)

加熱沸騰溶解後，分裝於試管或三角瓶內，以121°C滅菌15分鐘，最後pH值為7.1 ± 0.1。培養基注入培養皿前，應搖動混合，使絮狀沈澱物分散均勻，搖動時應避免產生氣泡，培養皿約倒入15～20 mL，凝固後打開皿蓋約1/2～1/4，使培養基之表面乾燥。已注入培養皿之培養基宜當天使用，在冰箱中貯存者，應於使用前檢查有無雜菌之污染。

1. 檢液之調製

2. 1. 液態檢體：

精確量取檢體 1 mL，置於滅菌試管，加入 MLB 9 mL，混合均勻，作為 10 倍稀釋檢液。

• 1. 固態與粉末檢體：

精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入經121°C滅菌15分鐘之Tween 80 1 mL，利用抹刀將檢體分散後，再加入MLB 8 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。

• 1. 面霜與油脂類檢體：

精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入經121°C滅菌15分鐘之Tween 80 1 mL、無菌玻璃珠5～7顆及MLB 8 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。

• 1. 噴霧劑：

以70%乙醇溶液濕潤之紗布消毒噴霧器之噴嘴，先從噴嘴噴出部分檢體於無菌紗布墊，丟棄，再將檢體噴灑於稀釋瓶中，精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入MLB 9 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。

• 1. 無水材料類檢體：參照2.3.2.與2.3.3.節。

依檢體之大小，適量取1～10 g(mL)，依2.3.節之方法加入適量之MLB，作為10倍稀釋檢液。

1. 鑑別試驗：

2.3.節之10倍稀釋檢液於30°C培養48小時，以無菌接種環取一環耳劃線培養於馬康奇培養基，於35°C培養24小時，觀察所形成菌落之生長狀態，取馬康奇培養基上紅色、無色、或淡粉紅色菌落，劃線培養於L-EMB培養基，於35°C培養24小時。

1. 判定：

大腸桿菌陽性者於L-EMB之菌落特徵為於反射光下有特殊光澤，於透射光下為藍黑色。