第一部分：好氣性生菌數之檢驗
Part Ⅰ：Test of Aerobic Plate Count
適用範圍：本方法適用於化粧品中好氣性生菌數之檢驗。
檢驗方法：檢體經系列稀釋後，以平板計數培養基培養及計數之方法。
2.1 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為 100 呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每 15 分鐘落菌數不得超過 15 CFU/培養皿。
2.2 器具及材料：
2.2.1 無塵無菌操作台。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1.0°C以內者。
2.2.4 天平：可秤量到2000 g，靈敏度為0.1 g；可秤量到120 g，靈敏度為5 mg。
2.2.5 旋渦混合器(Vortex mixer)。
2.2.6 酸鹼度測定儀(pH meter)。
2.2.7 菌落計數器：適用於菌落之計算者。
2.2.8 吸管輔助器(Pipette aid)。
2.2.9 吸管(Pipette)：已滅菌。1 mL吸管應有0.01 mL之刻度；5 mL 及10 mL吸管應有0.1 mL刻度。
2.2.10 玻璃珠：直徑約5～7 mm，已滅菌。
2.2.11 培養皿：已滅菌，內徑約90 mm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他缺點。
2.2.12 稀釋用容器：無菌袋或有100 mL、50 mL或10 mL標記附蓋(栓)之可滅菌廣口瓶或試管。
2.2.13 彎曲塗抹玻棒、紗布墊、藥勺、抹刀、剪刀及鑷子：可滅菌或可拋棄式者。
2.2.14 試藥：氯化鈉、亞硫酸氫鈉(NaHSO3)、膽汁鹽(bile salts No.3)、結晶紫(crystal violet)、中性紅(neutral red)、乳糖(lactose)、95%乙醇及油酸聚醇山梨酯 (Tween 80)均採用試藥級；Letheen培養液(Letheen broth)、Letheen洋菜(Letheen agar)、胰化酪蛋白腖 (trypticase peptone) 、硫蛋白腖 (thiotone peptone)、酵母抽出物(yeast extract)及洋菜(agar)均採用微生物級。
2.3. 70%乙醇溶液： 取95%乙醇560 mL，溶於蒸餾水200 mL，混合均勻。
2.4. 培養基：
2.4.1. 改良式Letheen培養液(Modified Letheen broth, MLB)：
| Letheen培養液(Letheen broth) | 25.7 g |
|---|---|
| 胰化酪蛋白腖(trypticase peptone) | 5 g |
| 硫蛋白腖(thiotone peptone) | 10 g |
| 酵母抽出物(yeast extract) | 2 g |
| 亞硫酸氫鈉(NaHSO3) | 0.1 g |
| 蒸餾水 | 1000 mL |
攪拌溶解後，分裝於適當容器中，經121°C滅菌15分鐘，最終pH值為7.2 ± 0.2。
2.4.2. 改良式Letheen瓊脂培養基(Modified Letheen agar, MLA)：
| Letheen洋菜(Letheen agar) | 25.7 g |
|---|---|
| 胰化酪蛋白腖(trypticase peptone) | 5 g |
| 硫蛋白腖(thiotone peptone) | 10 g |
| 酵母抽出物(yeast extract) | 2 g |
| 氯化鈉 | 5 g |
| 亞硫酸氫鈉(NaHSO3) | 0.1 g |
| 洋菜(agar) | 5 g |
| 蒸餾水 | 1000 mL |
加熱攪拌溶解後，分裝於適當容器中，經121°C滅菌15分鐘，最終pH值為7.2 ± 0.2。
2.4.3. 馬康奇培養基(MacConkey agar)：
| 聚蛋白腖(polypeptone) | 3 g |
|---|---|
| 蛋白腖(peptone) | 17 g |
| 乳糖(lactose) | 10 g |
| 膽汁鹽(bile salts No.3) | 1.5 g |
| 氯化鈉 | 5 g |
| 中性紅(neutral red) | 0.03 g |
| 結晶紫(crystal violet) | 0.001 g |
| 洋菜(agar) | 13.5 g |
| 蒸餾水 | 1000 mL |
加熱攪拌溶解後，煮沸1至2分鐘，經121°C滅菌15分鐘後，待冷卻至45～50°C後，分裝於適當培養皿中，於室溫下乾燥。 最終pH值為7.1 ± 0.2。
2.5. 檢液之調製：
檢體於開封前仔細檢查容器無任何的破損，將檢體振搖均勻混合，以70%乙醇溶液消毒檢體容器的表面，再以無菌紗布擦乾表面。
2.5.1. 液態檢體：
精確稱取檢體1 mL，置於滅菌試管，加入MLB 9 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。
2.5.2. 固態與粉末檢體：
精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入經121°C滅菌15分鐘之Tween 80 1 mL，利用抹刀將檢體分散後，再加入MLB 8 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。
2.5.3. 面霜及油脂類檢體：
精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入經121°C滅菌15分鐘之Tween 80 1 mL、無菌玻璃珠5～7顆及MLB 8 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。
2.5.4. 噴霧劑：
以70%乙醇溶液濕潤之紗布消毒噴霧器之噴嘴，先從噴嘴噴
出部分檢體於無菌紗布墊，丟棄，再將檢體噴灑於稀釋瓶中，精確稱取檢體1 g，置於滅菌試管，加入MLB 9 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。
2.5.5. 無水材料類檢體：參照2.5.2.及2.5.3.節。
2.5.6. 系列稀釋檢液：使用已滅菌之吸管，吸取上述之10倍稀釋檢液1 mL，加至MLB 9 mL中，依序作成10<sup>2</sup>～10<sup>6</sup>倍等系列稀釋檢液。
2.5.7. 檢體總量不足1 g (mL)時，應以全部檢體量，添加適量之MLB作為10倍稀釋檢液。
2.6. 生菌培養：
2.6.1. 將稀釋檢液或原液充分振搖，混合均勻。
2.6.2. 分別吸取各稀釋檢液0.1 mL至MLA，以無菌曲玻棒塗抹，各稀釋檢液至少進行二重複。
2.6.3. 取MLB 0.1 mL至MLA，以無菌曲玻棒塗抹作為空白對照組，進行二重複。
2.6.4. 待檢液被培養基吸收後，將培養基倒置，於30°C ± 2°C培養箱培養48小時。
2.7. 生菌數之計算：
經培養後，選取25～250個菌落之稀釋倍數平板來計數，將該稀釋倍數之兩個平板之菌落數平均值乘其稀釋倍數，即得其生菌數，單位為CFU/g或CFU/mL。
2.8. 增菌試驗：
經MLA培養基培養，無菌落生長，則需進行本試驗。
2.8.1. 取2.4.節各系列稀釋檢液，於30°C ± 2°C培養至7天，每天觀察是否有細菌生長。
2.8.2. 於7天內觀察到有生長時，所有增菌稀釋液取一接種環劃線培養於MLA及McConkey培養基上，於30°C ± 2°C培養48小時後，進行金黃色葡萄球菌_、_大腸桿菌及綠膿桿菌之檢測。